名称	50 T	贮藏条件
1、反应液A	ImL	-20°C
2、反应液B	ImL
3、阳性对照	250μL
4、阴性对照	250μL
5、PCR反应液	850μL
6、酶混合液	150μL

2、需自备材料：生理盐水、无菌枪头、荧光PCR用反应管、记号笔等。

【操作步骤】

一、样品制备

1、血液样品：采集抗凝血（抗凝剂为EDTA）或血清样品，编号备用。

2、组织样品：采集脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体等病变组织样品或软蜱0.1g（黄豆粒大小），眼科剪剪碎于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加1mL生理盐水混匀，4°C条件下8000 rpm/分钟离心2分钟，取上清液于灭菌离心管中，编号备用。

二、DNA提取

取反应液A 20μL分别加入到新的1.5mL离心管，加入抗凝而或血清或组织上清液2μL混匀，室温（20°C左右）静置3分钟，加入反应液B 20μL,吹打混匀即可，若为抗凝全血，则需8000rpm/分钟再离心2分钟后做为待检DNA溶液。

二、PCR扩增

1、配液：取出PCR反应液、酶混合液，在室温完全融化后，充分混匀，瞬离，可将酶混合液全部取岀直接加入到PCR反应液中，充分混匀，瞬离后按每份20μL分装使用；或按照每份PCR反应液17μL, 酶混合液3μL的比例取一定的试验用量，混合两种反应液,瞬离后按照每份20μL分装到用荧光PCR 反应管中，剩余试剂立即冻存；（操作过程要注意避光）

2、加样扩增：分别向上述PCR反应管中加入5μL样本 DNA或阴性对照或阳性对照，混匀并瞬离, 放入荧光PCR仪上运行以下程序：

步骤	条件	循环数
UNG处理	50°C： 2分钟	1
预变性	95°C： 3分钟	1
预扩増	95°C： 8 55C： 8	5
PCR扩增	95°C： 8 55°C： 8	40

　　荧光通道选择FAM,在40循环阶段每个循坏的55°C时收集荧光信号。设置扩增体系为25μL,同时要选择 passive reference 和 quencher 为的模式。

　　(注:若荧光PCR仪(如ABI7500)按说明书中的反应程序设置后因持温时间短无法运行,可将预扩增和PCR扩增条件变更为95°C： 5 55°C：30。)

【结果判定】

1、基线和阈值设定；基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照检测荧光曲线的高点为原则。

2、质量控制：反应结束后，阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，Ct值为＞38或无；阳性对照的Ct值应≤30.0,且明显的扩增曲线；否则实验视为无效。

3、样品判定：待检样品荧光信号有指数型增加，且结果显示Ct值<35.0,报告为阳性；未检测到Ct 值或Ct值＞38或无明显扩增曲线，则样品判定为阴性。35≤Ct值≤8时，复检一次，重复结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。

【注意事项】

1、实验请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行，在操作过程中对时间、试剂体积等精确控制可以获得好的结果。

2、实验室应严格按照有关规定分区管理。各区间人员、器材、试剂及空气流向应有产格要求。

3、有关耗材确保洁净、无菌，核酸提取完成后尽快进入下一步试验或冷冻保存。

4、预混后的试剂应尽量在短期内使用完毕，户外使用应在加冰袋的泡沫盒保存，每日试验完毕应及时冷冻保存。

5、对于荧光PCR管要避免徒手或使用过的手套接触，检测过程中使用不带荧光物质一次性乳胶手套。

6、冻存试剂使用应于室温下完全融化，充分混匀，瞬时离心使液体完全沉于管底。

7、样品、阴性对照封盖后，在通风环境添加阳性对照并及时封盖，避免组分间及气溶胶等假阳性污染。

8、扩增反应完毕后的PCR管严禁开盖,应和试验产生的其它废弃物一起及时收集,远离PCR实验室进行无害化处理。

【规格】50头份/盒。

【贮藏与有效期】-20°C以下避光保存，有效期12个月。

仅供兽医诊断使用

原创作者：山东天合环境科技有限公司

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